如何有效预防细胞培养过程的支原体污染

摘要：引起培养细胞污染的微生物有细菌、霉菌、黑胶虫、支原体等，其中支原体是常见的污染物。本文列举了一种我国药典认可的常见检测手段，也提出了行之有效的预防和解决办法。

关键字：细胞培养；实验室；支原体；预防；解决

细胞培养是一种体外增殖细胞的常规实验技术，目前被广泛用于教学、实验室和临床实验。污染控制是细胞培养能否成功的关键所在。引起培养细胞污染的微生物有细菌、霉菌、黑胶虫、支原体等，其中支原体是常见的污染物。

支原体属于缺乏细胞壁的原核微生物，直径约0． 13 ～0． 18 μm，大小介于细菌和病毒之间，可透过一般滤膜(0． 22 μm)，因此在细胞培养过程中，细胞极易受到支原体污染。已有许多调查及研究显示，世界范围内正在使用的细胞体系中支原体污染发生率达到 30% ～60% 。中国医学科学院基础医学研究所检测过的国内来源的细胞株系，支原体污染率高达 60% 。

 

支原体感染发生后培养液清澈不浑浊，但 pH 值变化明显，培养液更换后几小时内变为酸性(颜色变黄)。污染初期，显微镜高倍镜下观察发现细胞外形无明显变化但有细小黑色颗粒，所以不容易被发现。虽然支原体可以与细胞长期共存，且随着细胞换液而缓解，但细胞遭受支原体污染后会抑制细胞生长，改变细胞的 DNA /RNA 及蛋白表达，使细胞的转染效率大大降低，并在污染后期引起细胞变形，对后续教学、科研产生严重影响。因此在细胞培养过程中进行支原体检测十分必要。

一、检测手段

荧光染色法：将待测细胞分别培养于Φ3 cm培养皿中，细胞长到 70% ～ 80% 时进行荧光检测。首先，各组细胞用 PBS 清洗 2 次，每次1 min，4%多聚甲醛(PBS 配制)室温固定 20 min，再以含5 μg /ml Hoechst 33342 染料的 PBS 溶液进行染色，5 min 后吸去染液，PBS 洗涤一次，加入少量 PBS 使细胞保持湿润，在荧光显微镜下观察细胞。

二、检测结果

Hoechst 33342 是一种可透过细胞膜并对 DNA染色的细胞核染色试剂。荧光染色法检测支原体污染，就是利用 Hoechst 33342 可与双链 DNA 结合，在紫外光的激发下，释放强烈的蓝色荧光这一特点对细胞加以染色。经过染色，在荧光显微镜下，可见待测细胞1 的细胞周围或细胞膜上有大小不等、不规则荧光着色颗粒，推测为支原体污染细胞(图 1)，而待测细胞2 只有细胞核显色，推测为未污染细胞(图 2)

 

 

三、控制办法

1.保持操作环境清洁: 无菌室的滤膜要定期清洗和更换;每次进行细胞培养操作前，无菌室和超净台都要用诺福消毒剂消毒（诺福高工http://blog.sina.com.cn/u/3291672703）灭菌;每次实验完毕要用消毒剂浸泡的抹布擦拭操作台，避免交叉污染;定期对二氧化碳培养箱进行消毒灭菌。

2.实验用品无菌处理: 所有用品都要经过高温消毒灭菌;培养基、血清、胰酶等试剂均要经过检测确定无支原体污染后方可使用。

3.操作者遵守无菌室消毒规定: 由于正常人口腔带有支原体，因此进入无菌室一定要带好口罩、帽子(口罩必须罩住口鼻，帽子必须将头发全遮在里面)，鞋套，穿隔离衣，带乳胶手套，并用 75% 酒精擦拭手套表面。

4. 操作过程严格按照无菌操作要求: 开始要先用 75%用精棉球擦拭瓶口，在火焰上烧灼瓶口，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，瓶口要再次转动烧灼 ;操作时尽量不要讲话;要常更换吸管，一旦发现吸管触及手和其他物品应弃去。所有操作过程要在距离超净台边缘 10 cm 以内的无菌区域进行。

5. 定期进行支原体污染检测 : 对实验室中的培养物定期进行支原体检测，预防为主，不能等到发现有支原体污染时再进行检测，发现已经污染支原体的培养物，灭活后弃之，严禁随意倾倒、随意丢弃。及时更换新的培养物，避免支原体污染。

四、常规方法

很多生物安全实验室一直使用欧菲姆干雾过氧化氢灭菌设备，能迅速有效的杀灭支原体，减少日常维护和清洁的时间。作为一种新型的实验室消毒产品，欧菲姆干雾灭菌设备，具备实验室空间消毒灭菌的众多优势：

1.高效消毒灭菌：能够迅速杀灭病原菌（支原体、衣原体、立克次氏体）、芽孢在内的200多种微生物，灭菌原理特殊无耐受性产生；

2.设备体积小，操作方便，灵活移动满足不同空间需求，便于携带和移动；

3.品质保证，拥有众多检测批文和检测报告

4.无色无毒，无残留，安全可靠，完全分解为氧气和水；

5.验证资料齐全，提供验证模板，容易通过高标准灭菌验证；

6.杀菌时间超短，2-3个小时可完成整个灭菌流程，高效节能；

7.干雾气体性能稳定，不受环境湿度、温度、活性稳定攻击微生物活体；

8.性价比高，节约消毒成本。

 

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